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BCA蛋白定量試劑盒的使用方法和注意事項

發(fā)布日期： 2022-11-12
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 　　BCA蛋白定量試劑盒是根據(jù)目前世界上常用的兩種蛋白濃度檢測方法之一——BCA（bicinchoninicacid）法研制而成，實現(xiàn)了對蛋白質(zhì)進(jìn)行快速、穩(wěn)定、靈敏的濃度測定。本試劑盒的原理是蛋白質(zhì)分子中的肽鍵結(jié)構(gòu)在堿性環(huán)境下能與Cu2+絡(luò)合生成絡(luò)合物，將Cu2+還原成Cu+，而BCA試劑可敏感特異地與Cu+結(jié)合，形成穩(wěn)定的有顏色的復(fù)合物，并在562nm處有光吸收峰值，該復(fù)合物顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，可根據(jù)吸收值的大小來測定蛋白質(zhì)的含量。1h內(nèi)即可完成蛋白質(zhì)定量檢測。本試劑盒含有牛血清白蛋白（BSA）溶液作為蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，測定范圍為20-2000µg/ml。
 
　　使用方法
 
　　1.融化蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，取適量蛋白標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至終濃度為0.5mg/mL。蛋白樣品使用什么溶液溶解，標(biāo)準(zhǔn)品也應(yīng)用什么溶液稀釋，但是為了簡便起見，也可以用0.9%NaCl或PBS稀釋標(biāo)準(zhǔn)品。將標(biāo)準(zhǔn)品按0、1、2、4、8、12、16、20μL加到96孔板的標(biāo)準(zhǔn)品孔中，加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液補(bǔ)足到20μL，相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)品濃度分別為0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/mL。
 
　　2.根據(jù)樣品數(shù)量，按50體積BCA試劑A加1體積BCA試劑B(50:1)配制適量BCA工作液，充分混勻。例如5mLBCA試劑A加100μLBCA試劑B，混勻，配制成5.1mlBCA工作液。BCA工作液室溫24h內(nèi)穩(wěn)定。
 
　　3.加適當(dāng)體積樣品到96孔板的樣品孔中，也加稀釋液到20μL。
 
　　4.各孔加入200μLBCA工作液，37℃放置20~30min。也可以室溫放置2h，或60℃放置30min。
 
　　5.測定A562吸光值，540~595nm之間的波長也可接受。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出樣品的蛋白濃度。
 
　　注意事項
 
　　1.蛋白標(biāo)準(zhǔn)品配制后可立即使用，也可以-20℃長期保存。
 
　　2.BCA法測定蛋白濃度時，顏色會隨著時間的延長不斷加深。并且顯色反應(yīng)會因溫度升高而加快。如果濃度較低，適合在較高溫度孵育或適當(dāng)延長孵育時間以獲得更好檢測效果。
 
　　3.因為延長孵育時間會引起吸光值的變化，所以在用紫外分光光度計檢測時，應(yīng)盡可能加快檢測速度，以免先檢后檢產(chǎn)生系統(tǒng)誤差。
 
　　4.標(biāo)準(zhǔn)蛋白液的加量應(yīng)當(dāng)準(zhǔn)確，如果加量不準(zhǔn)確，會導(dǎo)致制作出來的標(biāo)準(zhǔn)曲線出現(xiàn)偏差，影響待測樣品的濃度計算，所以一方面需要用梯度稀釋的方法來配置標(biāo)準(zhǔn)蛋白液，另一方面應(yīng)使用精確度高的移液槍。