cDNA文庫構(gòu)建在研究具體某類特定細(xì)胞中基因組的表達(dá)狀態(tài)及表達(dá)基因的功能鑒定方便具有特殊的優(yōu)勢，從而使它在個體發(fā)育、細(xì)Chemicalbook胞分化、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞衰老和死亡調(diào)控等生命現(xiàn)象的研究中具有更為廣泛的應(yīng)用價值，是研究工作中最常使用到的基因文庫。
cDNA文庫構(gòu)建可以：
?。?）用于分離全長基因進(jìn)而開展基因功能研究；
?。?）篩選目的基因并直接用于表達(dá)；
?。?）提供構(gòu)建分子標(biāo)記連鎖圖譜的所用探針。
RNA的提取(例如異硫氰酸胍法，鹽酸胍—有機(jī)溶劑法，熱酚法等等，提取方法的選擇主要根據(jù)不同的樣品而定)Chemicalbook，要構(gòu)建一個高質(zhì)量的cDNA文庫，獲得高質(zhì)量的mRNA是至關(guān)重要的，所以處理mRNA樣品時必須仔細(xì)小心。
實驗操作步驟：
1.酚-氯仿對細(xì)胞裂解液進(jìn)行處理，加入結(jié)合有polyT的磁珠加入，再吸出磁珠并且洗脫留下mRNA。
2.瓊脂糖凝膠電泳檢測mRNA是否被裂解。
3.cDNA第一條鏈的合成：使用polyT作為引物，逆轉(zhuǎn)錄酶催化第一條鏈的合成。
4.cDNA第二條鏈的合成（引物合成法）
4.1.使用末端轉(zhuǎn)移酶向mRNA-cDNA雜合雙鏈3撇端加入polyC
4.2.NaOH水解mRNA，純化cDNA的第一條鏈
4.3.加入polyG作為引物。合成cDNA的第二條鏈
4.4.純化cDNA，使用單鏈特異性核酸酶對cDNA末端進(jìn)行處理，形成平末端
5.cDNA同載體連接：選擇使用λ噬菌體載體，使用限制性核酸內(nèi)切酶對載體和cDNA進(jìn)行處理，后使用DNA連接酶將二者連接起來。
6.體外包裝并轉(zhuǎn)化進(jìn)入受體細(xì)胞。
7.藍(lán)白斑篩選cDNA文庫。
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